Al CattaneoLab obiettivo Huntington

huntingtonSi dice che CRISPR, la nuova tecnica che consente di correggere il DNA lettera per lettera, abbia rivoluzionato la vita dei ricercatori. In questo blog racconteremo come viene usata in alcuni dei laboratori più importanti. Cominciamo dal CattaneoLab, il laboratorio di biologia delle cellule staminali e farmacologia delle malattie neurodegenerative dell’Università di Milano, dove la farmacologa Chiara Zuccato è impegnata, insieme agli altri ricercatori del gruppo diretto da Elena Cattaneo, a fare luce sulle basi molecolari della Corea di Huntington.

zuccato
“Abbiamo iniziato a usare CRISPR nel 2015 ed è una tecnica magica, fenomenale, ha cambiato la strategia dei nostri esperimenti. La malattia che studiamo, l’Huntington, colpisce il cervello ed è causata da mutazioni in un gene che, nella sua versione sana, serve a produrre una proteina importante per lo sviluppo e il funzionamento dei neuroni, l’huntingtina (HTT). Quando questo gene muta (la mutazione consiste nell’espansione di  triplette CAG ripetute) si produce una versione tossica della proteina che danneggia i neuroni e fa insorgere la malattia. Tra i nostri obiettivi  c’è lo studio delle funzioni di questo gene per verificare se sono compromesse dalla mutazione. Per riuscirci introduciamo mutazioni mirate nel gene e lo facciamo nelle cellule staminali embrionali di topo e anche umane. Quindi osserviamo se sono in grado di differenziarsi correttamente in neuroni. In pratica studiamo le correlazioni fra struttura e funzione.”

Che vantaggi offre la nuova tecnica?

“Quando ho cominciato a muovere i primi passi in laboratorio, nel 1999, servivano due o tre anni solo per ingegnerizzare il gene di interesse e potevamo anche non riuscirci. Si usava la ricombinazione omologa, la tecnica per cui ha ricevuto il Nobel Mario Capecchi. Ma è una tecnica difficile da usare, con un’efficienza molto bassa. Oggi, grazie a CRISPR, ci basta poco più di un mese. Un paio di settimane per ricevere dalla ditta fornitrice il kit su misura, che include l’enzima taglia-DNA (Cas9) e la guida di RNA che trova il punto esatto sul gene da editare. Altre due o tre settimane per eseguire l’esperimento. Nel nostro gruppo ci sono tre colleghi che si dedicano a tempo pieno a riscrivere parti di sequenza del gene Huntington con l’aiuto di CRISPR, due senior e un neolaureato.

Come facevate prima che arrivasse questa tecnica?

“Siccome la ricombinazione omologa richiede tempi lunghi e non sempre funziona, usavamo dei filamenti di DNA circolare (plasmidi) contenenti il gene d’interesse modificato (transgene), che si integravano in punti casuali del genoma delle cellule. Ogni cellula conservava il suo gene endogeno e in più riceveva il gene estraneo appositamente mutato. Sebbene questo sia un buon approccio per studiare la funzione genica, non rispecchia però quello che accade in una situazione fisiologica perché il transgene si inserisce in punti casuali e potrebbe interrompere sequenze di altri geni. Quindi era necessario produrre tante repliche (almeno 10 ) delle cellule ingegnerizzate (cloni) per essere certi che i risultati ottenuti non fossero un artefatto. Inoltre, abbiamo anche sempre validato i nostri risultati in modelli knock-in prodotti in collaborazione con gruppi esperti di ricombinazione omologa.  Oggi possiamo fare tutto molto più velocemente, con CRISPR, in un quindicesimo del tempo, modificando il gene endogeno senza aggiungere DNA estraneo. Si possono ordinare facilmente i reagenti su misura per ogni esperimento, per qualche centinaio di dollari. Ci sono anche dei blog in cui i ricercatori condividono i trucchi per migliorare le condizioni sperimentali. Insomma esiste una comunità aperta che si scambia informazioni sulla tecnica e questo aiuta a risolvere problemi e a raggiungere più velocemente un risultato.”

Quando vi accingete a riscrivere il gene, come scegliete quali mutazioni introdurre?

“Ci basiamo su un lavoro evoluzionistico che abbiamo iniziato circa 5 anni fa. Il gene che ci interessa è unico perché non ha altri geni simili nel genoma umano e quindi per studiarlo lo confrontiamo con il gene corrispondente in altre specie. Abbiamo una banca di DNA provenienti da più di 200 organismi diversi, dalle amebe ai ricci di mare, dai pesci agli anfibi, dai rettili ai mammiferi. C’è un nostro dottorando a Kyoto, che studia il gene nelle scimmie. Il gene Huntington è molto grande e produce una proteina di più di 3000 elementi di base (aminoacidi).  Confrontando le proteine di diverse specie abbiamo scoperto che la parte più interessante è rappresentata dai primi 500 aminoacidi che bastano da soli a svolgere funzioni importanti per i neuroni. Noi mutagenizziamo questa regione per capire se ci sono porzioni ancora più piccole, anche singoli aminoacidi, essenziali per lo svolgimento di queste funzioni”.

Come introducete l’enzima taglia-DNA e la sua guida dentro le cellule?

“Inseriamo il plasmide che contiene le sequenze per l’enzima Cas9 e per l’RNA guida dentro ai liposomi, che sono vescicole lipidiche, mettiamo la miscela sopra alle cellule da editare e i liposomi si fondono con la membrana citoplasmatica che le riveste, liberando il contenuto all’interno. Cas9 e RNA guida raggiungono quindi il sito bersaglio sul DNA da mutare”.

CRISPR presenta anche dei problemi?

“Può capitare che agisca anche in punti del DNA diversi da quelli desiderati, di solito sono siti simili all’obiettivo scelto. Accade però molto raramente perché la tecnica è veramente specifica. Se abbiamo il sospetto che questo possa accadere, una volta eseguito l’editing si può sequenziare il DNA cellulare per verificare che non ci siano effetti off-target. Ormai costa poco farlo.”

La tecnica viene continuamente perfezionata per renderla sempre più versatile e precisa. Voi usate solo la ricetta classica, quella con l’enzima Cas9?

“Abbiamo usato anche altre varianti, compresa quella che riconosce un sito bersaglio sul DNA senza tagliarlo, una variante specifica detta dead-Cas9 che può essere legata a proteine che attivano o silenziano promotori e che è quindi particolarmente utile quando vogliamo modulare l’espressione di un gene e non mutarlo. In situazioni diverse può essere più utile l’una o l’altra, è bello avere a disposizione più opzioni tra cui scegliere”.

(La foto di apertura mostra dei neuroni trasfettati con huntingtina)

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